MTT法檢測細(xì)胞活性步驟及原理

要知道MTT法檢測細(xì)胞活性步驟先要知道MTT是什么？

MTT是一種粉末狀化學(xué)試劑，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。

MTT法檢測細(xì)胞活性原理

檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?/span>
 

MTT法檢測細(xì)胞活性步驟

A.Hela細(xì)胞復(fù)蘇

1.從液氮容器中取出從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化；
2.從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上DEME培養(yǎng)液，混勻；
3.離心，1000rpm，5min；
4.棄去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度1×104個/mL，部分接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
5.次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，此后定期更換培養(yǎng)液，維持細(xì)胞正常活性。
 

B.MTT檢測復(fù)蘇細(xì)胞的細(xì)胞活性

Hela細(xì)胞計數(shù)用血細(xì)胞計數(shù)板的四個角上的方塊。

1.接種培養(yǎng)瓶同時，將其余部分接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，7組，每組5孔，每孔100μL,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
2.培養(yǎng)24h后，向每孔內(nèi)加入用磷酸緩沖液配制的0.5%MTT（5mg/mL）20uL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培育；
3.4h后終止培養(yǎng)，將孔內(nèi)培養(yǎng)液小心吸出。每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。同時每行的一孔設(shè)置為調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）。用酶標(biāo)儀OD570nm處測量各孔吸光值；
 

C.細(xì)胞生長曲線制作

接B.2，B.3步驟，連續(xù)測量7天，根據(jù)測量結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線。
[橫坐標(biāo)生長時間，縱坐標(biāo)吸光度值。]

D.探究某藥物對于細(xì)胞活性的影響

1.將之前培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用0.5%胰蛋白酶洗脫，加入DEME培養(yǎng)液制成細(xì)胞密度為1×106個/mL的細(xì)胞懸液；
2.設(shè)置空白對照組及5個不同藥物梯度的實驗組，分別加載96孔培養(yǎng)板內(nèi)（5個梯度劑量按藥物種類待定），每個劑量分別設(shè)置5個平行孔，每孔加入細(xì)胞懸液100μL（在加藥的前下午完成鋪板）；
3.次日上午按預(yù)先設(shè)置的藥物梯度加藥，后置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；
4.每孔加入20μLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h（若藥物能與MTT反應(yīng)，可以先離心后棄去上清液，用PBS沖洗2-3遍后再加入MTT溶液）
5終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；
6.每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀OD490nm處測量各孔的吸光度；
7.同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

E.Hela細(xì)胞凍存?

1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；
2.取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則直接細(xì)胞移15ml離心管中；
3.離心1000rpm，5min；
4.去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的終密度為5×106/ml～1×107/ml；
5.將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5?ml；
6.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間及操作者；
7.凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/?min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，可增-5℃～-10
℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h?，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

MTT法檢測細(xì)胞活性其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氧酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。MTT法檢測細(xì)胞活性該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。